Beste microbe

Share Tweet Pin it

Sinds de tijd van Pasteur bekend is dat het menselijke maagdarmkanaal, in wezen bioreactor stroomtype waarin meerdere organismen bewonen. De houding van wetenschappers ten opzichte van de darmmicroflora is in deze periode radicaal veranderd. Honderd jaar geleden, de grote Ilya Mechnikov, de grondlegger van de moderne theorie van de immuniteit, voor het creëren van die hij ontving de Nobelprijs (voor twee personen met zijn onverzoenlijke tegenstander, niet minder dan de grote Paul Ehrlich), stelde zelfs voor de verwijdering van de dikke darm als een manier om het leven te verlengen. En degenen aan wie deze maatregel leek te radicaal, aanbevolen drink veel van yoghurt om de schadelijke te verplaatsen, naar zijn mening, microben heilzaam lactobacillen. In een halve eeuw is de koers met 180 graden veranderd. Het bleek dat de normale darmflora, evenals de huid en slijmvliezen, tot vele nuttige functies vervullen - bijvoorbeeld, te onderdrukken vitale functies van het lichaam worden constant aanvallende ziekteverwekkers. En in de afgelopen jaren, de meest gedurfde van microbiologen zijn verder gegaan door te verklaren persoon en zijn symbiotische microben enkele superorganism.

De ontwikkeling van moleculaire biologische technieken heeft geleid wetenschappers een nieuw niveau van begrip van het proces van de symbiose van de mens en de microflora, die leek goed bestudeerd, en uit de studie die geen verrassingen had verwacht. De hoge groeisnelheid en een daling van de kosten van DNA-sequencing methoden (bepaling van de nucleotidesequentie) en een gelijktijdige toename in de kracht van personal computers en de ontwikkeling van het internet het mogelijk om informatie over grote gebieden van het genoom te analyseren. Na chromosoom werden honderd individuele bacteriesoorten getranscribeerd in een nieuwe microbiële genetica aanpak - aantal inwoners: analyse van de genen in een keer alle bacteriën bewonen een specifiek habitat. Natuurlijk bleek de populatie van de "menselijke bioreactor" een van de belangrijkste voor het bestuderen van microbiële populaties.

Het eerste werk, dat een nieuwe kijk gaf op de intestinale microbiota, werd in 1999 gepubliceerd door een groep wetenschappers van het National Institute of Agronomic Research (Frankrijk) en de University of Reading (Groot-Brittannië). De auteurs besloten om de methode van sequentiebepaling van 16S RNA-genen te gebruiken om de microbiële darmpopulatie te bestuderen.

16S RNA - identificatie van bacteriën

Sinds de tijd van Pasteur eerste en noodzakelijke stap bij de bepaling van micro-organismen werd op de teelt voedingsmedia. Maar veel belangrijke (en nuttige en pathogene) microben willen niet op een van de media groeien. Studie voorheen ontoegankelijke cultiveerbare bacteriën en beginnen te ruimen de uiterst verwarrende taxonomie van bekende prokaryoten mogelijk geworden met de ontwikkeling van bioinformatica en de komst van moderne moleculair-biologische technieken - polymerase chain reaction (PCR), waarbij een enkel stuk DNA maakt miljoenen en miljarden exacte kopieën verkrijgen kloon geïsoleerd uit PCR-genen in bacteriële plasmiden en nucleotide sequentie werkwijzen, de resulterende dit alles voldoende ana Iza bedrag.

Een ideale merker voor identificatie van micro-organismen aangetoond dat codeert voor 16S ribosomaal RNA (elk van beide ribosomale subeenheden - workshops cellulaire eiwitsynthese - uit interlaced ketens van eiwitmoleculen en ribonucleïnezuren).

Dit gen is in het genoom van alle bekende bacteriën en archaea, maar afwezig in eukaryoten en virussen, en als je zijn karakteristieke sequentie van nucleotiden vinden - weet u zeker dat u te maken met de genen van prokaryoten. (Om heel precies te zijn, 16S RNA gen daar en in eukaryoten, maar niet in de nucleaire chromosomen en mitochondriën Hieruit blijkt opnieuw dat de mitochondriën -. Verre nakomelingen van symbiotische bacteriën van het eerste eukaryote organismen).

Dit gen heeft zowel conservatieve sites, hetzelfde voor alle prokaryoten, en soortspecifiek. Conservatieve percelen voor de eerste trap polymerasekettingreactie - toevoeging van het doel DNA aan de primers (seed DNA-delen waaraan onderzochte nucleotideketen moeten deelnemen te beginnen analyseren van de rest van de sequentie) en soortspecifieke - voor soorten identificatie. Bovendien weerspiegelt de mate van overeenkomst van soort-specifieke locaties heel goed de evolutionaire relatie van verschillende soorten.

Een extra bonus - voor het klonen en de daaropvolgende analyse kunt u het ribosomale RNA zelf gebruiken, dat in elke cel in een veel grotere hoeveelheid aanwezig is dan het overeenkomstige gen. Alleen moeten we het eerst "herschrijven" in DNA met behulp van een speciaal enzym - reverse transcriptase.

Nucleotide-sequenties van 16S-RNA van alle bekende bacteriën en archaea (ongeveer 10.000 soorten) zijn in het algemeen beschikbaar. Geïdentificeerde sequenties worden vergeleken met die in databases en identificeren nauwkeurig de soort van de bacterie of verklaren deze tot de volgende niet-gecultiveerde soort.

Sinds kort is er een intensief onderzoek van de oude, de fenotypische classificatie van bacteriën op basis van slecht geformaliseerd criteria - van het uiterlijk van de kolonies om voedsel voorkeuren en de mogelijkheid om te worden geschilderd verschillende kleurstoffen. De nieuwe systematiek is gebaseerd op moleculaire criteria (16S-RNA) en repliceert slechts gedeeltelijk fenotypisch.

De coderende sequenties van 16S RNA door PCR werd direct teruggewonnen uit de "omgeving" - 125 mg menselijk, sorry, ontlasting, werd ingevoegd in de plasmide van E. coli (niet omdat het de darmen, en omdat Escherichia coli - een van de favoriete werkpaard moleculaire biologen ) en weer geïsoleerd uit de kweek van vermenigvuldigde bacteriën. Aldus werd een bibliotheek van 16S-RNA-genen voor alle micro-organismen in het monster gecreëerd. Daarna werden willekeurig 284 klonen geselecteerd en de sequentie ervan bepaald. Het bleek dat slechts 24% van de resulterende 16S-RNA-sequenties behoorde tot eerder bekende micro-organismen. Driekwart van de microflora in de darmen van ieder mens, zijn er meer dan honderd jaar de aandacht van onderzoekers vermeden, gewapend met de methoden van klassieke microbiologie! De wetenschappers kon gewoon niet aan de voorwaarden voor het kweken van deze bacteriën te vinden, omdat de meest grillige inwoners darm weigerde te stijgen naar de traditionele microbiële omgevingen.

Tot op heden, met behulp van moleculaire technieken gevonden dat volwassen menselijke microbiota presenteerde 10 van de 70 belangrijkste bacteriële taxa. Ongeveer 90% van onze microben behoren tot de Firmicutes type (dit omvat bijvoorbeeld, de beroemde lactobacilli - de belangrijkste "schuldigen" verzuren melk) en Bacteroidetes - obligaat anaëroben (organismen die kunnen leven alleen in de afwezigheid van zuurstof), die vaak worden gebruikt als een indicator van verontreiniging Riolering van natuurlijk water. De resterende 10% van de bevolking verdeeld taxa Proteobacteriën (deze omvatten, onder andere E. coli), Actinobacteria (van een van de soort Actinomycetes antibioticum streptomycine werd geïsoleerd), Fusobacteriën (normale inwoners van de mondholte en veroorzaken vaak parodontitis), Verrucomicrobia (recentelijk in geothermische bron werd ontdekt in de vorm van micro-organismen die zich voeden met methaan, die in overvloed in de darm als gevolg van andere micro-organismen), cyanobacteriën (ze zijn nog steeds vaak aangeduid als de oude naam van "blauw-groene algen»), Spirochaeates (voor Wait Tew, niet vaal), Synergistes en VadinBE97 (wat voor soort dieren, vragen de makers van de nieuwe taxonomie van prokaryoten).

Ondanks het feit dat de soortensamenstelling van de darmmicro-organismen nogal eentonig is, kan de kwantitatieve verhouding van vertegenwoordigers van bepaalde systematische groepen in de microbiota van verschillende mensen sterk variëren. Maar wat is een normale intestinale microflora en wat zijn de manieren om het te vormen?

Deze vraag werd beantwoord in het werk van 2007 van een groep Amerikaanse biologen onder leiding van Patrick Brown van Stanford University. Ze volgden de vorming van microbiota bij 14 pasgeboren baby's gedurende het eerste levensjaar. De auteurs slaagden erin verschillende bronnen van kolonisatie van het maag-darmkanaal te vestigen. Microbiota van zuigelingen was vergelijkbaar met de microflora van de moeder: vaginaal, fecale microflora of moedermelk monsters. Afhankelijk van de bronnen van de kolonisatie in de darmflora van zuigelingen tijdens het eerste jaar van het leven werd gedomineerd door verschillende soorten. Deze verschillen bleven significant gedurende de hele onderzoeksperiode, maar op de leeftijd van één jaar werden de kenmerken van de vorming van een volwassen microbiota duidelijk. Interessante gegevens werden verkregen met behulp van een tweeling. Hun microflora was praktisch identiek qua samenstelling en varieerde op dezelfde manier. Deze bevinding onthulde de enorme rol van de menselijke component van het gastheer-microbiota-paar bij de vorming van de intestinale microflora-populatie. Voor de zuiverheid van het experiment moeten we de baby's natuurlijk scheiden in het ziekenhuis - een geweldig verhaal voor de Indiase film! Jaren later leren ze elkaar kennen door analyse... Maar andere studies hebben de aanname bevestigd dat individuele, waaronder erfelijk geconditioneerde, kenmerken van menselijke biochemie een grote invloed hebben op de samenstelling van zijn microbiota.

Microbieel in ons meer dan menselijk

In aanvulling op de studie van bepaalde darmflora, in de afgelopen jaren, veel onderzoekers bestuderen bacteriële metagenom - een set van genen van alle organismen in een monster van de inhoud van de menselijke darm (of roodheid van de huid of in de modder monster uit de zeebodem). Daartoe de geautomatiseerde, geautomatiseerde en krachtige DNA sequencing technieken, die het mogelijk korte nucleotidesequenties analyseren verzamelen puzzle meerdere samenvallende "letters" aan de einden van deze gedeelten, verschillende Herhaal deze procedure voor elk deel van het genoom en decoderen van afzonderlijke genen en chromosomen ontvangen op een snelheid tot 14 miljoen nucleotiden per uur - orden van grootte sneller dan een paar jaar geleden. Aldus werd gevonden dat de humane darmflora heeft ongeveer 100 bacteriële cellen trillionov - ongeveer 10 keer meer dan het totale aantal van de voornaamste cellen van het lichaam. De set van genen die deel uitmaken van bacteriële metagenoom ongeveer 100 maal het aantal genen van het menselijk lichaam. Als we praten over het bedrag van de biochemische reacties die zich in de microbiële populatie, het weer vele malen hoger dan die van het menselijk lichaam. Bacteriële "reactor" implementeert in een gastheer metabolisch keten dat niet in staat is om zichzelf te ondersteunen - bijvoorbeeld de synthese van vitaminen en hun voorlopers, de ontleding van sommige toxinen, afbraak van cellulose verteerbare polysacchariden (bij herkauwers), etc.

Studies uitgevoerd in het laboratorium van Jeffrey Gordon (School voor Geneeskunde aan de Universiteit van Washington, St. Louis, Missouri) lieten toe om de soortendiversiteit van bacteriën van het maagdarmkanaal te verbinden met het dieet en de eigenaardigheden van het metabolisme van het individu. De resultaten van het experiment zijn gepubliceerd in het decembernummer van Nature in 2006. Het jaarlijkse experiment stelde voor om een ​​verband te leggen tussen het overgewicht in een persoon en de samenstelling van de microbiële populatie van zijn darm. Een tiental dikkerds die ermee instemden om hun buik op het altaar van de wetenschap te zetten, werden in twee groepen verdeeld. Eén dorp met een vetarm dieet, het tweede - met een laag koolhydraatgehalte. Alle vrijwilligers verloren gewicht en tegelijkertijd veranderden ze de verhouding van de twee hoofdgroepen van darmmicro-organismen: het aantal Firmicutes-cellen nam af en het aantal Bacteroidetes nam juist toe. Op een vetarm dieet werd deze verandering later merkbaar - nadat patiënten 6% van het gewicht en een koolhydraatarm dieet hadden verloren - na het verliezen van de eerste kilogram (2% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht). Tegelijkertijd was de verandering in de samenstelling van de microflora des te meer uitgesproken, hoe kleiner het aantal deelnemers aan het experiment.

Gelijktijdig in dezelfde laboratoriumproeven werden uitgevoerd op laboratorium muizen die een mutatie in het gen voor leptin - "verzadiging hormoon" eiwit dat wordt gesynthetiseerd in vetweefsel cellen, en zet zijn bijdrage aan de vorming van verzadiging. Muizen waarin beide kopieën van het beschadigde gen (deze mutant wordt aangeduid door een index Lep ob), eet 70% meer dan het wildtype, met alle gevolgen van dien. Een content Firmicutes in hun darmen en een half keer hoger dan die van de heterozygote lijnen, met slechts één defecte allel (ob / +), en homozygoot voor het normale gen wild-type stammen (+ / +).

Invloed van microflora op het metabolisme van zijn "gastheer" testten de onderzoekers op een ander model - gnotobiotische muizen.

Dergelijke dieren, vanaf het moment van geboorte in steriele kamers en nog nooit microben in hun leven tegengekomen, worden niet vaak gebruikt in biomedisch onderzoek. Absolute steriliteit myshatnike, fokkerij en vooral geiten schuur - een duur en lastig, en na een ontmoeting met de eerste microbe of virus of slechte matrijs of ongeschikt worden voor verdere experimenten. Wat gebeurt er in gnotobiote met het immuunsysteem - is een ander verhaal, en ze eten voor drie en op hetzelfde moment - de huid en botten te wijten aan een gebrek aan microbiële vertering component.

Na transplantatie van de microflora van de obese (ob / ob) donoren, werden de gnotobiotische muizen bijna 50% vetgemest gedurende twee weken (met 47%). Degenen die werden "gezaaid" met microflora van wild-type (+ / +) donoren met een normaal gewicht, herstelden slechts met 27%.

De resultaten van verdere studies van veranderingen in het symbiotische muis-microbiële organisme bevestigden briljant de hypothese dat de microbiota van zwaarlijvige individuen bijdraagt ​​aan een diepere verwerking van voedsel. Vergelijking van ontlasting DNA-monsters van obese en normale muizen toonden aan dat de muizen van obese muizen verzadigd zijn met enzymgenen die een efficiëntere ontleding van polysacchariden mogelijk maken. De darm van obese muizen bevatte grote hoeveelheden eindfermentatieproducten - azijn- en boterzuurverbindingen, wat wijst op een diepere verwerking van voedselcomponenten. Calorimetrische analyse (van het woord "calorieën"!) Analyse van ontlastingsmonsters bevestigde dit: de stoel van de ob / ob-muizen bevat minder calorieën dan muizen van het wilde type die de energie uit voedsel niet volledig absorbeerden.

In aanvulling op de belangrijke informatie over de "kiem" component van obesitas, de auteurs in staat waren om de fundamentele gelijkenis tussen de microflora van zwaarlijvige mensen en muizen, die nieuwe perspectieven in de studie van het probleem van overgewicht, en misschien opent laten zien - en om dit probleem op te lossen door "transfer" gezonde microflora of zijn vorming bij patiënten, lijden aan obesitas.

Het feit dat de microbiota de host stofwisseling kan beheren is niet meer in twijfel. Studies Gordon laboratorium gewijd aan het probleem van overgewicht maakte het mogelijk om het gat naar de behandeling van metabole ziekten, zoals cachexia te overbruggen, invloed op kinderen van het ene jaar tot vier jaar in arme tropische landen - marazmus (aan de idiotie dat woord alleen taalkundig: Grieks marasmos. betekent letterlijk uitputting, uitsterven) en kwashiorkor (in de taal van een van de stammen van Ghana kwashiorkor - "red boy"). Het optreden van ziekten die samenhangen met een gebrek aan eiwitten en vitaminen in de overgang van borstvoeding voor voeding voor volwassenen. Maar de ziekte selectief aantast kinderen van wie de broeders en zusters hebben niet ervaren problemen met de overgang naar het traditionele dieet van deze regio. Studies hebben aangetoond dat de darmflora van zieke kinderen is heel anders dan de microflora van hun ouders, evenals de microflora van gezonde broers en zussen. In de eerste plaats merkte de bijna volledige afwezigheid van intestinale populaties van Bacteroidetes en overheersing van zeldzame soorten die behoren tot de soorten Proteobacteriën en Fusobacteriën. Na zieke kinderen (dat evenwel niet tot een overdosis!) Vetgemest hard-eiwit eten, hun microbiota wordt vergelijkbaar met de normale, zoals familieleden, met een overwicht van Bacteroidetes en Firmicutes.

Studies van de afgelopen jaren hebben niet alleen de heersende opvattingen over de intestinale microflora van de mens radicaal veranderd, maar hebben ook bijgedragen tot de opkomst van een concept dat de intestinale microbiota beschouwt als een extra meercellig "orgaan" van het menselijk lichaam. Een orgaan dat bestaat uit verschillende cellijnen die zowel met elkaar als met het gastheerorganisme kunnen communiceren. Een orgaan dat energiestromen herverdeelt, belangrijke fysiologische reacties uitvoert, verandert onder invloed van de omgeving en zichzelf herstelt met veranderingen veroorzaakt door externe omstandigheden.

Vervolg onderzoek "bacteriële body" kan en moet leiden tot een goed begrip van de wetten van de werking ervan, de bekendmaking van zijn delicate relatie met de gastheer en, als gevolg daarvan, de opkomst van nieuwe methoden ter bestrijding van ziekten bij de mens door gerichte behandeling van disfuncties beide metaorganizma componenten.

Valery Poroiko, Ph.D.
University of Chicago, Department of General Surgery
Portal «Eternal Youth» www.vechnayamolodost.ru

De tijdschriftversie van het artikel is gepubliceerd in "Popular Mechanics" nr. 4-2008

Specifieke identificatie van bacteriën door middel van de sequentiebepaling van het 16S-gen van ribosomaal RNA, de rol en de plaats van de methode bij de diagnose van bacteriële infecties Voltooid: Savelyeva. - presentatie

De presentatie werd 4 jaar geleden gepubliceerd door юумихина

Gerelateerde presentaties

Presentatie van de 11e klas over het onderwerp: "Specifieke identificatie van bacteriën door de methode van het sequencen van het 16S-gen van ribosomaal RNA, de rol en plaats van de methode bij de diagnose van bacteriële infecties Voltooid: Savelyeva.". Download gratis en zonder registratie. - Transcript:

1 Identificatie van soorten bacteriën door sequentiebepaling van het 16S gen van ribosomaal RNA, de rol en de plaats van de werkwijze bij de diagnose van bacteriële infecties voldaan: Savelieva Xenia voldaan: Savelieva Xenia, pupil 11 speciale klasse pupil 11 speciale klasse MBOU Krasnoobsk SOSH 1 MBOU Krasnoobsk SOSH 1 Promotor: Supervisor : Cand. biol. Wetenschappen Afonyushkin Vasily Nikolaevich Cand. biol. Wetenschappen Afonyushkin Vasily Nikolaevich

2 Doelstellingen: 1. DNA elektroforese beheersen in een agarosegel 2. Om de methode voor de analyse van sequentiebepalingsresultaten leren en uitvoeren van de constructie van nucleotidesequenties, genfragmenten 16 S ribosomaal RNA isolaten verkregen meester het genus Bacillus 1. DNA elektroforese in een agarosegel 2. Om de werkwijze te leren voor het analyseren sequentiebepalingsresultaten en het uitvoeren van de constructie van nucleotidesequenties, genfragmenten 16 S ribosomaal RNA isolaten verkregen genus Bacillus 3. Onderzoek perspectivisch delen sequentietechnieken en biochemie cal identificatie van bacteriën 3. Om de mogelijkheden van het delen sequencing methoden bestuderen en biochemische identificatie van bacteriën Doel: Om de mogelijkheden van de middelen voor het specifiek identificeren van bacteriën bestuderen door sequentiebepaling van 16S ribosomaal RNA in combinatie met traditionele identificatiemethoden

3 Materialen en werkwijzen Zuivere culturen van de isolaten werden uitgeplaat op MPA uur na incubatie van de bacteriële suspensie werd bereid in fosfaatgebufferde zoutoplossing. De kweken werden gekleurd door Gram en microscopisch. Geëvalueerd na biochemische eigenschappen: Verwijdering citraat, malonaat, glucose, lactose, mannitol, sucrose, inositol, sorbitol, arabinose, maltose, fenylalanine, de vorming van indool, waterstofsulfide, atsetilmetilkarabinola (reactie Foges- Proskauer), de aanwezigheid van beta-galactosidase, urease, arginine decarboxylase en lysine, hydrolasen van arginine. Kweken werden getest op catalase, cytochroom oxidase activiteit, de vorming van nitrieten, pigmentsynthese, antibioticaresistentie, en bestudeerden de cultuur en morfologische eigenschappen. Beta-galactosidase, en tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu activiteit werd getest op medium Uriselekt 4 (BioRad) Het DNA werd geïsoleerd door fenolhloroformennym oog bepaald op basis van de sequentie van 16S ribosomaal gen RNAi fragment van de intergene afstandhouder van ribosomaal RNA en 16-23S aantal biochemische, culturele en morfologische kenmerken.

4 Culturele eigenschappen: een volwassen cultuur niet groeien op een medium dat is Endo geen betrekking op enterobacteriën, gekweekt op een vlees-pepton agar onder aerobe omstandigheden bij 37 ° C kleurende eigenschappen: gekweekte microscopisch onderzocht en Gram-kleuring die manier konden aantonen dat de verkregen cultuur spore Gy + stokken Kenmerken Cultures

5 Onderzoeksplan: DNA werd gegroeid uit de gekweekte kweken en PCR werd toegepast met universele primers, als een resultaat amplificeerden we een fragment van het 16S-gen van ribosomaal RNA

6 met een primeroplossing verdeeld in 4 testbuisjes, die elk vier deoxynucleotide dATP, dCTP, dTTP (radioktivnym een ​​isotoop gemerkt) en één van de vier 2 3- dideoxynucleotiden (ddATR, ddTTR, ddGTP, dd MFR) dideoxynucleotide het is in alle standen van groeiende ketens mengsel en na toetreding tot de ketengroei onmiddellijk gestopt. Dientengevolge, in elk van de vier buizen met deelname van DNA polymerase gegenereerd een unieke set olignukleotidov verschillende lengten omvattende praymerovuyu sequentie. Verder werden de buizen formalid divergentie ketens toegevoegd en aan elektroforese op een gel van polyacrylzuur cheteryh tracks. Autoradiografie brengen, die het mogelijk maakt te "lezen" de sequentie nucleïnezuur sequentie van het DNA-segment. In de biochemie en moleculaire biologie elektroforese wordt gebruikt om macromoleculaire eiwitten en nucleïnezuren (en fragmenten daarvan) te scheiden. Er zijn veel varianten van deze methode. Deze werkwijze vindt ruime toepassing voor het scheiden van mengsels van biomoleculen in fracties of afzonderlijke stoffen en wordt gebruikt in de biochemie, moleculaire biologie, klinische diagnostiek, populatiebiologie (voor het bestuderen van genetische variatie) en dr.belkovnukleinovyh zuren Elektroforese deze elektrokinetische verschijnsel verplaatsing van de gedispergeerde fase (colloïd of proteïne oplossing) in een vloeibaar of gasvormig medium onder invloed van een extern elektrisch polya.elektrokineticheskoe yavlenieelektricheskogo polyaElektroforez Schema studies: De PCR producten werden gescheiden door elektroforese op een agarosegel. Sanger's methode

7 Resultaten van eigen onderzoek Fig.1 Resultaten van capillaire elektroforese van een fragment van het 16 S-gen van ribosomaal RNA

8 Fig. 2 een fylogenetische boom geconstrueerd op basis van de resultaten van uitlijning van een fragment van het 16S-gen van ribosomaal RNA

9 Resultaten van eigen onderzoek Fig. 3 Resultaten van vergelijking van nucleotidesequenties

10 Resultaten van biochemische studies kweken test gebruiken PBDE Biochemische eigenschappen van de stam B. licheniformis: negatief gebruik citraat, malonaat negatief, natriumcitraat + glucose negatief negatief lysine, arginine negatief, negatief ornithine, fenylalanine negatief, indool negatief, urease positieve atsetilmetilkarabinol negatief sulfide negatief, positief, glucose, b-galactosidase positieve, negatieve lactose, mannitol positief, positief sucrose, inositol positief o, sorbitol is positief, maltose is positief

11 Conclusie De soortspecifieke identificatie van micro-organismen op basis van sequencing kan de "gouden standaard" van laboratoriumdiagnostiek zijn, maar de nauwkeurigheid van de methode wordt beperkt door de betrouwbaarheid en volledigheid van de GenBank-databases en vereist daarom aanvullend gebruik van confirmerende tests.

Analyse van 16s RNA

Biotechnology, 2005, №6, van 3-11

Een methode voor de identificatie van micro-organismen op basis van de analyse van restrictiefragmentlengte-polymorfisme (PCRF) van een 16S RNA-genproduct met een lengte van 1500 nucleotiden wordt voorgesteld. 6 passende set van restrictie-endonucleasen (Sse9I, Tru9I, BsuRI, Mspl, BstMBI en RsaI), via RFLP maakt de identificatie van een groot aantal micro-organismen.
Vier isolaten van thermolabiele alkalische fosfatase werden geïsoleerd uit natuurlijke zeewaterisolaten. De analyse van PFR voor deze stammen in vergelijking met de berekende resultaten verkregen voor de 16S RNA-genen van verschillende micro-organismen maakte het mogelijk vast te stellen dat de geïdentificeerde producenten tot het geslacht Alteromonas behoren.

Naast de traditionele werkwijzen voor identificatie van micro-organismen met behulp cultuur en morfologische kenmerken, evenals chemische en biochemische reacties [1], in de laatste tijd meer en meer gebruikt voor de bepaling van micro-organismen gebaseerd op een vergelijking van nucleotidesequenties van genen van verschillende micro-organismen [2-4] en analyse van het polymorfisme van DNA restrictiefragmenten verkregen door amplificatie van specifieke bacteriële genen [5,6]. De meeste zijn geschikt voor het identificeren van de genen die de 16S en 23S ribosomale RNA's omdat zij in alle bacteriële cellen zijn genus-specifieke en voor de meeste micro-organismen [7-9]. Met een DNA-fragment dat beide genen 16S- en 23S RNA en een afstandhouder daartussen gelegen sporen en variabeler zijn, maakt onderscheid te maken tussen nauw verwante soorten en ondersoorten van micro-organismen [10].

Dit document presenteert de resultaten van RFLP-analyse van het PCR product 1500 nucleotiden lang voor verschillende micro-organismen en aangetoond dat het gebruik van restrictie-endonucleasen 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, Mspl, BstMBI RsaI en betrouwbaar kunnen identificeren meeste micro-organismen. Het document worden 4 nieuwe producent thermolabiel alkalisch fosfatase en de voorgestelde werkwijze wordt een vergelijkende analyse van de RFLP voor de identificatie van deze micro-organismen. Op basis van de vergelijking tot de conclusie dat de resultaten producenten behoren tot het geslacht Alteromonas.

EXPERIMENTELE VOORWAARDEN

Het detecteren produceren thermolabiel alkalisch fosfatase 50 liter zeewater werd getritureerd op voedingsagar oppervlak en geanalyseerd zoals beschreven in [11]. 27,5, MgCl - bereiding van microbiële biomassa werd uitgevoerd door het kweken produceren bij 20 ° C in medium met 1% trypton (AGS GmbH, Duitsland), 0,5% gistextract (hetzelfde bedrijf) en zeezout water (NaCl2 - 5, MgSO4 - 2, CaCl2 - 0,5, KCl - 1, FeSO4 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2 - 7,7. De zaadvloeistof werd verdeeld in maatkolven van 200 ml tot 700 ml en gedurende 16 uur geschud bij 150 rpm.

Isolatie van chromosomaal DNA werd uitgevoerd met de methode van [13].

Amplificatie van het 16S-gen van ribosomaal RNA werd uitgevoerd door polymerasekettingreactie zoals beschreven in [14].

De restrictiereactie van het geamplificeerde DNA werd gedurende 4 uur bij 37 ° C uitgevoerd in 20 μl van een reactiemengsel dat eeq bevat. act. de restrictie-enzymen Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI of RsaI van de SibEnzyme NGO, in de overeenkomstige buffer. De reactie werd gestopt door de toevoeging van 5 μl van een stopoplossing die 0,1 M EDTA, 0,05% broomfenolblauw en 40% sucrose bevat.

De elektroforetische scheiding van de restrictieproducten van het geamplificeerde DNA werd uitgevoerd in 2% agarose (Sigma) in trisacetaatbuffer met ethidiumbromide (0,5 mg / l) bij 120 V gedurende 4 uur.

DNA-molecuulgewichtmarkers (100bp +1,5 Kb DNA-markers, NGO "SibEnzim") werden gebruikt om de lengte van DNA-fragmenten te bepalen. De lengte van de verkregen beperking werd bepaald met behulp van het computerprogramma Gel Pro Analyzer, versie 4.0.00.001. Het percentage identiteit van fragmentlengtes werd berekend voor elk paar micro-organismen door de restrictiepatronen afzonderlijk voor elk restrictie-enzym te vergelijken. Bij het vergelijken van de lengte van de restrictie, werd geschat dat DNA-fragmenten met dezelfde lengte niet meer dan 5% verschilden.

Om experimentele gegevens te vergelijken met gepubliceerde sequenties van 16S RNA-genen, werd een genetische database van sequentie-sequenties gebruikt.

RESULTATEN EN BESPREKINGEN

Van de natuurlijke zeewaterisolaten isoleerden we vier thermolabiele fosfatase-producerende stammen aangeduid als 20, 27, 48 en een stam die eerder werd gekenmerkt [11] met behulp van traditionele werkwijzen als Alteromonas undina. Om de stammen te identificeren verkregen uit de biomassa van micro-organismen gekweekt in een vloeibaar voedingsmedium met de toevoeging van mariene zouten, werd chromosomaal DNA geïsoleerd.
Vervolgens chromosomaal DNA werd gebruikt in polymerase kettingreactie een 16S ribosomaal RNA-gen amplificeren. Het amplificatieproduct behandeld onafhankelijk 6 verschillende restrictie endonucleases. Alle we hebben gebruikt tetranucleotidesequentie restrictie-endonuclease herkenningsplaats, waardoor verkrijgen 3-8 DNA fragmenten die resulteren uit de splitsing van het amplificatieproduct met een lengte van ongeveer 1500 bp. Restrictie-enzym en gebruikt Sse9I Tru9I respectievelijk AATT herkenningsplaatsen en TTAA dat BsuRI en Mspl restrictie-enzym knipplaatsen van GGCC en CCGG. Restrictie-enzym herkenningsplaatsen BstMBI en RsaI respectievelijk GATC en GTAC, bevat in zijn samenstelling alle vier nucleotiden. Een dergelijke keuze van restrictie-endonucleasen is, naar onze mening bieden flexibiliteit bij de identificatie van micro-organismen met zowel AT- rijk of GC- rijke genomen. In kwantitatief opzicht is het gebruik van slechts zes verschillende restrictie geloven we optimaal, omdat het gebruik van restrictie-endonucleasen 1 of 3, zoals gesuggereerd in diverse studies [10,15] kan niet polymorfismen detecteren voor identificatie van nauw verwante organismen of, als alternatief, leiden tot te grote verschillen iz voor een of meer willekeurige mutaties. Echter endonucleasen het gebruik van 10 verschillende restrictie veroorzaken extra polymorfisme detectie van DNA restrictiefragmenten duidelijk redundant [9].
Figuur 1 toont de gesimuleerde toepassing van een computerbeeld beperking genov16S RNA, hebben we een set van zes restrictie-enzymen (Sse9I, Tru9I, BsuRI, Mspl, BstMBI en RsaI) voorgesteld. Genen van 16S-RNA worden in de genetische bank van sequencesequenties genomen. De keuze voor micro-organismen was vrij willekeurig. Alle bacteriën behoren tot verschillende geslachten en vertegenwoordigen zowel gram-negatieve als gram-positieve micro-organismen. Het is duidelijk dat voor alle micro-organismen een uniek patroon van een reeks restrictie-enzymen bestaat. Het aantal DNA-fragmenten varieert van 23 tot 30 (de lengte van fragmenten van minder dan 100 paren nucleotiden wordt niet in aanmerking genomen). Resultaten van de berekening van het percentage identiteit van de lengtes van DNA-fragmenten (restrictiefragment als dezelfde lengte verschillen met niet meer dan 5%) voor verschillende paren van micro-organismen weergegeven in Tabel 1. Deze tabel toont slechts een deel van mogelijke paren van micro-organismen in Fig. 1. De gepresenteerde vergelijkingsresultaten zijn echter tamelijk typerend en laten toe dat het percentage identiteit van DNA-fragmentlengten gewoonlijk varieert van 12-28% voor vertegenwoordigers van verschillende microbiële geslachten. De gepresenteerde gegevens tonen dus aan dat de restrictiepatronen van de 16S RNA-genen door de restrictie-enzymset die door ons is voorgesteld, kunnen dienen als een basis voor het identificeren van de generieke hulpstof van bacteriële cellen.

Fig. 1. Theoretisch berekende patroon van de elektroforetische scheiding van 16S RNA-gen amplificatieproducten na behandeling met restrictie-enzymen Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), Mspl (4), BstMBI (5) en RsaI (6). Tracks M - marker voor molecuulgewicht

De waarde van 16S RNA in taxonomie. Moleculaire hybridisatie van 16S RNA.

Moleculaire hybridisatie van 16S-rRNA. Prokaryoot ribosoom bestaat uit 3 subeenheden, groot (23S), (5S) en (16S). Gene 16S rRNA heeft de volgende eigenschappen, belangrijk in fylogenie:

1. RNA De ribosomen zijn universeel voor verschillende soorten, zoals de ribosomen zelf. 2. Molecuul 16S-rRNA is conservatief en het minst onderhevig aan veranderingen in de loop van de biologische evolutie. De snelheid van verandering van het 16S rRNA-gen in verschillende symbiotische bacteriën was 2-4% van nucleotidesubstituties binnen 60 my.3. Gene 16S rRNA heeft zowel ultraconservatieve als variabele domeinen (domeinen), wat het mogelijk maakt om verre en nauw verwante relaties te evalueren.4. Bovendien Bovendien werd gevonden dat rRNA-cystrons niet betrokken zijn bij de processen van interspeciale genetische overdracht.5. De maat gen (in prokaryoten is het ongeveer 1550-1640 bp lang) is optimaal vanuit het oogpunt van het verminderen van statistische fouten. De volledige sequentie kan in één sequentie bepaald worden met de Sanger-methode.Vergelijking van nucleotide-catalogi. De methode werd begin jaren 80 gebruikt en had een grote historische betekenis in de systematisering van bacteriën. In dit geval werd het RNA-molecuul (16S-rRNA) behandeld met ribonuclease T, dat het molecuul splitst over de residuen van guanine. De grootte van de verkregen fragmenten was niet meer dan 20 nucleotiden. De resulterende oligonucleotiden werden gescheiden door 2-meer elektroforese, gesequeneerd, en vormden een catalogus die specifiek het rRNA-molecuul kenmerkt. Bij het vergelijken van de catalogi werden fragmenten van ten minste 6 nucleotiden in aanmerking genomen. Door de overeenkomstcoëfficiënten tussen de catalogi toe te passen, werd eerst een algemene fylogenetische boom voor prokaryoten geconstrueerd. Riboprinting. De methode is gebaseerd op de restrictieanalyse van rRNA-genen. Om dit te doen isoleert u het totale DNA uit de cel. Twee primers die homoloog zijn aan de sterk geconserveerde flankerende gebieden van het 16S-rRNA (kleine subeenheid-ss-rDNA) van het gen worden genomen en PCR wordt uitgevoerd. De fragmenten worden behandeld met verschillende restrictie-endonucleasen en de restrictieproducten voor elk van de endonucleasen worden gescheiden in een agarosegel samen met het grootteprofiel van het DNA. Polymorfisme van fragmentlengtes ontstaat als gevolg van het feit dat enkele van de restrictieplaatsen in de conservatieve domeinen van het gen vallen, en sommige in de variabele domeinen. Tegelijkertijd zullen sommige fragmenten gemeenschappelijk zijn voor alle soorten in het monster. Door het aantal gemeenschappelijke en verschillende fragmenten is het mogelijk om de genetische afstand tussen soorten te berekenen. Het gebruik van 12 restrictie-enzymen met herkenningsplaatsen van 4 nucleotiden lang maakt het mogelijk om 10-15% van de 16S rRNA-genlengte te dekken door analyse, zonder toevlucht te nemen tot sequentiebepaling.

Beste microbe

Valery Poroiko,
Ph.D., University of Chicago, Department of General Surgery
Populaire mechanica №4, 2008

Slechts honderd jaar geleden werden microben die in de darm van de mens leefden beschouwd als vrijlozen en plagen. In de afgelopen jaren is de menselijke microbiota een soort orgaan van ons lichaam genoemd, noodzakelijk voor het normale leven van het lichaam.

Sinds de dagen van Pasteur is het bekend dat het menselijke maagdarmkanaal in wezen een stromingstype bioreactor is waarin vele micro-organismen zich bevinden. De houding van wetenschappers ten opzichte van de darmmicroflora is in deze periode radicaal veranderd. Honderd jaar geleden, de grote Ilya Mechnikov, de grondlegger van de moderne theorie van de immuniteit, voor het creëren van die hij ontving de Nobelprijs (voor twee personen met zijn onverzoenlijke tegenstander, niet minder dan de grote Paul Ehrlich), stelde zelfs voor de verwijdering van de dikke darm als een manier om het leven te verlengen. En degenen aan wie deze maatregel leek te radicaal, aanbevolen drink veel van yoghurt om de schadelijke te verplaatsen, naar zijn mening, microben heilzaam lactobacillen. In een halve eeuw is de koers met 180 graden veranderd. Het bleek dat de normale microflora van de darm, evenals de huid en slijmvliezen, vele nuttige functies vervult - bijvoorbeeld onderdrukt het de vitale activiteit van pathogene micro-organismen die het lichaam aanvallen. En in de afgelopen jaren, de meest gedurfde van microbiologen zijn verder gegaan door te verklaren persoon en zijn symbiotische microben enkele superorganism.

De ontwikkeling van methoden van moleculaire biologie heeft wetenschappers naar een nieuw niveau van begrip geleid van de symbioseprocessen van de mens en zijn microflora, die goed bestudeerd leken en van de verdere studie waarvan ze geen bijzondere verrassingen verwachtten. Snelle groei van snelheid en kostenreductie van DNA-sequentiemethoden (bepaling van de nucleotidesequentie) en parallelle groei van pc-kracht en ontwikkeling van internet maakten het mogelijk informatie over grote secties van genomen te analyseren. Nadat de chromosomen van honderden soorten individuele bacteriën waren ontcijferd, ontstond er een nieuwe benadering in de genetica van micro-organismen: een populatiebenadering: de analyse van de genen van alle bacteriën die in een bepaald gebied woonden. Natuurlijk bleek de populatie van de "menselijke bioreactor" een van de belangrijkste voor het bestuderen van microbiële populaties.

Het eerste werk, dat een compleet nieuwe kijk gaf op de darmmicrobiota, werd in 1999 gepubliceerd door een groep wetenschappers van het National Institute of Agronomic Research (Frankrijk) en de University of Reading (VK). De auteurs besloten om de methode van sequentiebepaling van 16S RNA-genen te gebruiken om de microbiële darmpopulatie te bestuderen (zie zijbalk).

16S PHK - identificatie van bacteriën

De eerste fase van de bepaling van micro-organismen is hun cultivatie op voedingsbodems. Maar een aantal microben willen niet op een van de media groeien

Moderne technieken
Studie voorheen ontoegankelijke niet-kweekbare bacteriën en gaan teneinde in zeer verwarrend taxonomie reeds bekende prokaryotische leggen mogelijk geworden met de ontwikkeling van bioinformatica en de komst van moderne technieken van moleculaire biologie - PCR maakt het mogelijk DNA-gebied miljarden replica ontvangt, kloneren van het geselecteerde gen in bacteriële plasmiden en sequencing sequenties methodologieën nucleotiden verkregen in een voldoende hoeveelheid voor analyse. Een ideale merker voor identificatie van micro-organismen aangetoond dat codeert voor 16S ribosomaal RNA (elk van beide ribosomale subeenheden - workshops cellulaire eiwitsynthese - uit interlaced ketens van eiwitmoleculen en ribonucleïnezuren).

Perfecte marker
Dit gen is in het genoom van alle bekende bacteriën en archaea, maar afwezig in eukaryoten en virussen, en als je zijn karakteristieke sequentie van nucleotiden vinden - weet u zeker dat u te maken met de genen van prokaryoten. Dit gen heeft zowel conservatieve sites, hetzelfde voor alle prokaryoten, en soortspecifiek. Conservatieve percelen voor de eerste trap polymerasekettingreactie - toevoeging van het doel DNA aan de primers (seed DNA-delen waaraan onderzochte nucleotideketen moeten deelnemen te beginnen analyseren van de rest van de sequentie) en soortspecifieke - voor soorten identificatie. De mate van overeenkomst van soort-specifieke sites weerspiegelt de evolutionaire relatie van verschillende soorten. Voor klonering en daaropvolgende analyse kan ribosomaal RNA zelf worden gebruikt, dat in elke cel in een grotere hoeveelheid dan het overeenkomstige gen aanwezig is. De nucleotidesequenties van het 16S-RNA van alle bekende bacteriën en archaea zijn in het algemeen beschikbaar. Geïdentificeerde sequenties worden vergeleken met die in databases en identificeren de soort van de bacterie of verklaren deze tot een niet-gecultiveerde soort.

Nieuwe systematiek
Onlangs is er een intensieve herziening geweest van de oude, fenotypische classificatie van bacteriën op basis van slecht geformaliseerde criteria - van het verschijnen van kolonies tot voedselvoorkeuren en het vermogen om met verschillende kleurstoffen te kleuren. De nieuwe systematiek is gebaseerd op moleculaire criteria (16S-RNA) en repliceert slechts gedeeltelijk fenotypisch.

Wat hebben we vanbinnen?

De coderende sequenties van 16S RNA door polymerase kettingreactie (PCR) werd direct van de "omgeving" ingetrokken - 125 mg humaan, sorry, ontlasting werd ingevoegd in E. coli plasmide (niet omdat het de darmen, en omdat Escherichia coli - een van de favoriete werkpaarden van moleculair biologen) en weer geïsoleerd van de cultuur van vermenigvuldigde bacteriën. Aldus werd een bibliotheek van 16S-RNA-genen voor alle micro-organismen in het monster gecreëerd. Daarna werden willekeurig 284 klonen geselecteerd en de sequentie ervan bepaald. Het bleek dat slechts 24% van de resulterende 16S-RNA-sequenties behoorde tot eerder bekende micro-organismen. Driekwart van de microflora in de darmen van ieder mens, zijn er meer dan honderd jaar de aandacht van onderzoekers vermeden, gewapend met de methoden van klassieke microbiologie! De wetenschappers kon gewoon niet aan de voorwaarden voor het kweken van deze bacteriën te vinden, omdat de meest grillige inwoners darm weigerde te stijgen naar de traditionele microbiële omgevingen.

Tot op heden, met behulp van moleculaire technieken gevonden dat volwassen menselijke microbiota presenteerde 10 van de 70 belangrijkste bacteriële taxa. Ongeveer 90% van onze microben behoren tot de Firmicutes type (dit omvat bijvoorbeeld, de beroemde lactobacilli - de belangrijkste "schuldigen" verzuren melk) en Bacteroidetes - obligaat anaëroben (organismen die kunnen leven alleen in de afwezigheid van zuurstof), die vaak worden gebruikt als een indicator van verontreiniging Riolering van natuurlijk water. De resterende 10% van de bevolking verdeeld taxa Proteobacteriën (deze omvatten, onder andere E. coli), Actinobacteria (van een van de soort Actinomycetes antibioticum streptomycine werd geïsoleerd), Fusobacteriën (normale inwoners van de mondholte en veroorzaken vaak parodontitis), Verrucomicrobia (recentelijk in geothermische bron werd ontdekt in de vorm van micro-organismen die zich voeden met methaan, die in overvloed in de darm als gevolg van andere micro-organismen), cyanobacteriën (ze zijn nog steeds vaak aangeduid als de oude - "een blauw-groene algen»), spirochaeten (gelukkig nd, niet vaal), Synergistes en VadinBE97 (wat voor soort dieren, vragen de makers van de nieuwe taxonomie van prokaryoten).

Microbieel in ons meer dan menselijk

Daartoe de geautomatiseerde, geautomatiseerde en krachtige DNA sequencing technologie, die de bezoeker korte nucleotidesequentie analyseren assembleren de puzzel meer overlappende "letters" aan de einden van deze sites herhaaldelijk deze procedure herhaald voor elk deel van het genoom en transcripten van afzonderlijke genen en chromosomen ontvangt snelheden tot 14 miljoen nucleotiden per uur - door ordes van grootte sneller dan we hadden maar een paar jaar geleden. Aldus werd gevonden dat de darmflora heeft ongeveer 100000000000000 bacteriecellen - ongeveer tien keer meer dan het totale aantal humane cellen in het lichaam.

De reeks genen waaruit het bacteriële metagenoom bestaat, is ongeveer honderd keer groter dan de reeks genen van het menselijk lichaam. Als we het hebben over het volume van biochemische reacties die plaatsvinden binnen de microbiële populatie, overtreft het opnieuw herhaaldelijk het volume van biochemische reacties in het menselijk lichaam.

Bacteriële "reactor" voert ze samen metabole keten dat niet in staat is om zichzelf te ondersteunen - bijvoorbeeld de synthese van vitaminen en hun voorlopers, de ontleding van sommige toxinen, afbraak van cellulose verteerbare polysacchariden (bij herkauwers), enz...

Van kleutertijd tot ouderdom

Ondanks het feit dat de soortensamenstelling van de darmmicro-organismen nogal eentonig is, kan de kwantitatieve verhouding van vertegenwoordigers van bepaalde systematische groepen in de microbiota van verschillende mensen sterk variëren. Maar wat is een normale intestinale microflora en wat zijn de manieren om het te vormen?

Deze vraag werd beantwoord in het werk van 2007 van een groep Amerikaanse biologen onder leiding van Patrick Brown van Stanford University. Ze volgden de vorming van microbiota bij 14 pasgeboren baby's gedurende het eerste levensjaar. De auteurs slaagden erin verschillende bronnen van kolonisatie van het maag-darmkanaal te vestigen. Microbiota van zuigelingen was vergelijkbaar met de microflora van de moeder: vaginaal, fecale microflora of moedermelk monsters. Afhankelijk van de bronnen van de kolonisatie in de darmflora van zuigelingen tijdens het eerste jaar van het leven werd gedomineerd door verschillende soorten. Deze verschillen bleven significant gedurende de hele onderzoeksperiode, maar op de leeftijd van één jaar werden de kenmerken van de vorming van een volwassen microbiota duidelijk. Interessante gegevens werden verkregen met behulp van een tweeling. Hun microflora was praktisch identiek qua samenstelling en varieerde op dezelfde manier. Deze bevinding onthulde de enorme rol van de menselijke component van het "microbiota-gastheer" -paar in de vorming van de intestinale microflora-populatie. Voor de zuiverheid van het experiment, zou het natuurlijk beter zijn om de baby's terug in het ziekenhuis te scheiden (trouwens, een geweldig verhaal voor een Indiase film!) Twins leren van elkaar door de analyse van microflora. Maar de gegevens van andere studies bevestigden de veronderstelling dat individuele, waaronder erfelijk geconditioneerde, kenmerken van menselijke biochemie een grote invloed hebben op de samenstelling van zijn microbiota.

Dun en dik

Studies uitgevoerd in het laboratorium van Jeffrey Gordon (School of Medicine in Washington University, St. Louis, MO), zal de diversiteit van bacteriën van het maagdarmkanaal met het dieet en de kenmerken van de individuele stofwisseling te koppelen. De resultaten van het experiment zijn gepubliceerd in het decembernummer van het tijdschrift natuur voor het jaar 2006. Het jaarlijkse experiment stelde voor om een ​​verband te leggen tussen het overgewicht in een persoon en de samenstelling van de microbiële populatie van zijn darm. Een tiental dikkerds die ermee instemden om hun buik op het altaar van de wetenschap te zetten, werden in twee groepen verdeeld. Eén dorp met een vetarm dieet, het tweede - met een laag koolhydraatgehalte. Alle vrijwilligers verloren gewicht en tegelijkertijd veranderden ze de verhouding van de twee hoofdgroepen van darmmicro-organismen: het aantal Firmicutes-cellen nam af en het aantal Bacteroidetes nam juist toe. Op een vetarm dieet werd deze verandering later merkbaar - nadat patiënten 6% van het gewicht en een koolhydraatarm dieet hadden verloren - na het verliezen van de eerste kilogram (2% van het oorspronkelijke lichaamsgewicht). Tegelijkertijd was de verandering in de samenstelling van de microflora des te meer uitgesproken, hoe kleiner het aantal deelnemers aan het experiment.

Obesitas bestrijden

De resultaten van nader onderzoek door wetenschappers veranderen de muis-symbiotische micro-organisme (zie. Box "getest op muizen") briljant bevestigde de hypothese dat de microbiota van obese personen verhoogt de diepe verwerking van voedsel. Vergelijking van ontlasting DNA-monsters van obese en normale muizen toonden aan dat de muizen van obese muizen verzadigd zijn met enzymgenen die een efficiëntere ontleding van polysacchariden mogelijk maken. De darm van obese muizen bevatte grote hoeveelheden eindfermentatieproducten - azijn- en boterzuurverbindingen, wat wijst op een diepere verwerking van voedselcomponenten. (! Vanaf het woord "calorieën") calorimeter analyse van de monsters bevestigd dat de muizen stoel: stoel ob / ob-muizen bevatten minder calorieën dan in wild-type muizen die niet volledig van de energie werden opgenomen uit de voeding.

In aanvulling op de belangrijke informatie over de "kiem" component van obesitas auteurs waren in staat om de fundamentele gelijkenis tussen de microflora van zwaarlijvige mensen en muizen, die nieuwe perspectieven opent in de studie van het probleem van overgewicht te laten zien, en eventueel op te lossen dit probleem op door "transfer" gezonde microflora of zijn vorming bij patiënten lijden aan obesitas.

Getest op muizen

En met uitputting

Het feit dat de microbiota de host stofwisseling kan beheren is niet meer in twijfel. Het onderzoek van het laboratorium van Gordon, gewijd aan het probleem van overgewicht, maakte het mogelijk de brug over te brengen naar de behandeling van stofwisselingsziekten. Onder hen zijn dergelijke veel voorkomende uitputtingstypes, die kinderen van één tot vier jaar treffen in arme landen met een tropisch klimaat, zoals marasmus (voor marasmus heeft dit woord alleen een taalkundige relatie: Grieks. marasmoz betekent letterlijk uitputting, uitsterven) en kwashiorkor (in de taal van een van de stammen van Ghana kwashiorkor - "de rode jongen"). Het optreden van ziekten die samenhangen met een gebrek aan eiwitten en vitaminen in de overgang van borstvoeding voor voeding voor volwassenen. Maar de ziekten treffen selectief kinderen, waarvan de broers en zussen geen problemen ondervonden met de overgang naar een traditioneel dieet voor de regio. Studies hebben aangetoond dat de darmflora van zieke kinderen is heel anders dan de microflora van hun ouders, evenals de microflora van gezonde broers en zussen. In de eerste plaats merkte de bijna volledige afwezigheid van intestinale populaties van Bacteroidetes en overheersing van zeldzame soorten die behoren tot de soorten Proteobacteriën en Fusobacteriën. Nadat de zieke kinderen (voorzichtig, niet te overdosis!) Werden vetgemest met sterk eiwitrijk voedsel, werd hun microbiota vergelijkbaar met normaal, zoals die van familieleden, met het overwicht van Bacteroidetes en Firmicutes.

Recente studies niet alleen radicaal veranderd de heersende opvattingen van de menselijke darmflora, maar ook bijgedragen aan de opkomst van het concept, dat de darmflora als een extra multi-cellulaire "body" van de mens beschouwt. Een orgaan dat bestaat uit verschillende cellijnen die zowel met elkaar als met het gastheerorganisme kunnen communiceren. Een orgaan dat energiestromen herverdeelt, belangrijke fysiologische reacties uitvoert, verandert onder invloed van de omgeving en zichzelf herstelt met veranderingen veroorzaakt door externe omstandigheden. Vervolg onderzoek "bacteriële body" kan en moet leiden tot een goed begrip van de wetten van de werking ervan, de bekendmaking van zijn delicate relatie met de gastheer en, als gevolg daarvan, de opkomst van nieuwe methoden ter bestrijding van ziekten bij de mens door gerichte behandeling van disfuncties van de twee componenten metaorganizma.

Analyse van 16s RNA

Ribosomale ribonucleïnezuren (rRNA) - verschillende RNA-moleculen die de basis vormen van het ribosoom. De belangrijkste functie van rRNA is de implementatie van het proces van vertaling - het lezen van informatie uit mRNA door aanpassing van tRNA-moleculen en katalyse van de vorming van peptidebindingen tussen de aangehechte aminozuren van tRNA.

inhoud

Ribosomale subdeeltjes en nomenclatuur van rRNA

Op elektronenmicroscopische beelden van intacte ribosomen valt op dat ze uit twee deeldeeltjes van verschillende groottes bestaan.

De verhouding van de massa's van de subdeeltjes is

2: 1; massa beurt, uitgedrukt in constanten gemeten direct sedimentatie (neerslagsnelheid in Svedberg eenheden, S) ultratsentrifugovanii, en wordt deze parameter ligt ten grondslag aan nomenclatuur rRNA en ribosomen en ribosomale subeenheden: soort benaming

Ribosomaal prokaryotisch RNA met een sedimentatiecoëfficiënt van 16 Svedberg-eenheden wordt bijvoorbeeld aangeduid als 16S-rRNA.

Omdat de sedimentatiecoëfficiënten niet alleen afhankelijk zijn van het molecuulgewicht, maar ook van de vorm van de deeltjes, zijn de sedimentatiecoëfficiënten voor dissociatie niet additief: bijvoorbeeld bacteriële ribosomen met een molecuulmassa

3 * 10 6 Dalton heeft een sedimentatiecoëfficiënt van 70S, aangeduid als 70S en dissocieert in subeenheden van 50S en 30S:

Ribosomale subdeeltjes bevatten één rRNA-molecuul van grote lengte, waarvan de massa is

1/2 - 2/3 van de massa van het ribosomale subdeel, dus, in het geval van bacteriële ribosomen 70S, bevat het 50S subdeel 23S rRNA (lengte

3000 nucleotiden) en het 30S subdeel bevat 16S rRNA (lengte

1500 nucleotiden); grote ribosomale subeenheid, behalve voor de "lange" rRNA ook een of twee "korte" rRNA (5S rRNA van bacteriële 50S ribosomale subeenheden en 5S rRNA en 5,8S bolshii eukaryotische ribosomale subeenheden).

synthese

Ribosomaal RNA is verantwoordelijk voor een groot deel (tot 80%) van het totale cellulaire RNA; een dergelijke hoeveelheid rRNA vereist een intensieve transcriptie van de coderende genen ervan. Deze intensiteit wordt geleverd door een groot aantal kopieën van de rRNA-coderende genen: in eukaryoten zijn er enkele honderden (

200 gist) tot tienduizenden (voor verschillende katoenlijnen meldden 50 - 120 duizend kopieën) van genen die waren georganiseerd in reeksen van tandemherhalingen.

Bij mensen zijn genen die coderen voor rRNA ook georganiseerd in groepen van tandemherhalingen die zich bevinden in de centrale gebieden van de korte arm 13, 14, 15, 21 en 22 chromosomen.

Ze worden gesynthetiseerd door RNA-polymerase I als een langmolecuul pre-ribosomaal RNA, dat in afzonderlijke RNA's wordt gesneden, die de basis vormen van de ribosomen. In bacteriën en archaea omvat het initiële transcript gewoonlijk 16S, 23S en 5S rRNA, waartussen de pre-rRNA-sequenties zijn verwijderd die tijdens de verwerking zijn verwijderd. Gewoonlijk bevinden één of meer tRNA-genen zich tussen de 16S- en 23S-rRNA-genen; Dus, in E. coli heeft het initiële transcript van een dergelijke groep genen de volgende sequentie:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Een dergelijk transcript wordt opgesplitst in fragmenten van pre-rRNA en tRNA door ribonuclease III.

In eukaryoten, 18S, 5,8S-rRNA en 25/28 co-getranscribeerd door RNA polymerase I, terwijl de 5S rRNA gen transkibiruetsya RNA polymerase III.

In eukaryoten, genen concentratie ruimte rRNA coderen, meestal duidelijk zichtbaar in de celkern, als gevolg van ophoping van ongeveer subeenheden ribosomen, die zichzelf samenstel vindt onmiddellijk. Deze accumulaties zijn goed gekleurd met cytologische kleurstoffen en staan ​​bekend als de nucleolus. Derhalve is de aanwezigheid van nucleoli niet specifiek voor celcyclus fasen: de verdeling van een celkern in profase dissocieert omdat rRNA synthese en geresuspendeerd eind telofase gevormd bij het hervatten rRNA synthese.

Vergelijkende analyse van pro- en eukaryote rRNA

Ribosomaal RNA (zoals ribosoom) prokaryoten en eukaryoten verschillen van elkaar, maar vertonen significante sequentiegelijkenis delen. Prokaryotische 70S ribosoom omvat een groot 50S subunit (berekend aan de hand van twee moleculen rRNA - 5S en 23S) en 30S kleine subeenheid (berekend op basis van 16S rRNA). 80S eukaryotische ribosoom bestaat uit een grote 60S subunit (berekend op basis van drie moleculen rRNA - 5S, 5,8S en 28S) en 40S kleine subeenheid (berekend op basis van 18S rRNA).

Sequentie-informatie gebruiken

Informatie over het rRNA van een bepaald organisme wordt gebruikt in de geneeskunde en de evolutionaire biologie.

  • Het rRNA-gen is een van de meest conservatieve (minst variabele) genen. Daarom kan de systematische positie van het organisme en de tijd van divergentie met verwante soorten worden bepaald op basis van een analyse van overeenkomsten en verschillen in rRNA-sequenties.
  • rRNA is het doel van een groot aantal antibiotica, waarvan sommige worden gebruikt in de klinische praktijk, zowel voor het remmen van de groei van bacteriën (antibiotica, prokaryotische ribosoom bindende) en voor de behandeling van menselijke ziekten (antibiotica binden aan eukaryote ribosomen). De eerste groep bestaat uit chlooramfenicol, erythromycine, kasugamycine, mikrokokksin, spectinomycine, streptomycine, thiostrepton. De tweede hygromycine B, paromomycine.

Gerelateerde Artikelen Hepatitis